خلاصة
يمكن أن يؤدي داء السكري من النوع الثاني إلى اعتلال عضلة القلب السكري، الذي يتميز بالتهاب مزمن جهازي، واضطراب في التمثيل الغذائي، وضعف في وظائف القلب. ومع ذلك، لا يزال من غير المعروف ما إذا كان التهاب القلب موجودًا في اعتلال عضلة القلب السكري، وما إذا كان مرتبطًا بشكل سببي بإعادة تشكيل التمثيل الغذائي. وقد افترض الباحثون أن دواء AZD1656 (AZD)، وهو منشط لإنزيم جلوكوكيناز، يوفر تحكمًا في مستوى السكر في الدم لدى مرضى السكري من النوع الثاني من خلال تأثيره على البنكرياس والكبد. إلا أن AZD فشل في السيطرة على ارتفاع السكر في الدم في التجارب السريرية. ومع ذلك، أشارت تجربة الدواء على مرضى السكري من النوع الثاني المصابين بكوفيد-19، كجزء من تجربة ARCADIA، إلى تأثير مناعي معدل. لذلك، استخدمنا نموذج الفأر db/db لاعتلال عضلة القلب السكري، ومنهجًا تجريبيًا متكاملًا داخل الجسم وخارجه، لدراسة تأثيرات AZD على اضطرابات وظائف القلب والتمثيل الغذائي والالتهاب. أظهرت فئران db/db البالغة من العمر 20 أسبوعًا، والتي تحمل سمات اعتلال عضلة القلب البشري dbCM (السمنة، وارتفاع سكر الدم، واختلال وظيفة الانبساط)، والتي عولجت لمدة ستة أسابيع بدواء AZD، تحسنًا في إعادة تشكيل التمثيل الغذائي، وتخفيفًا لاختلال وظيفة الانبساط، وانخفاضًا في حجم الاحتشاء، وتحسنًا في التعافي الوظيفي بعد نقص التروية مقارنةً بفئران dbCM غير المعالجة، إلى جانب تحسن في النمط الظاهري المناعي للقلب، بما في ذلك انخفاض التليف الناتج عن الخلايا التائية وتسلل الخلايا البائية. لذلك، قد يوفر استهداف التمثيل الغذائي المناعي نهجًا علاجيًا جديدًا لعلاج اختلال وظائف القلب واضطراب التمثيل الغذائي وتقليل حجم الاحتشاء في اعتلال عضلة القلب dbCM.
مقدمة
اعتلال عضلة القلب السكري (dbCM) هو أحد مضاعفات داء السكري من النوع الثاني (T2D)، ويتسم بضعف وظائف القلب، واضطراب عمليات الأيض، والتهاب جهازي، وبالتالي زيادة في معدل الإصابة بأمراض القلب الإقفارية وفشل القلب<sup> 1،2 </sup> . يُعاني قلب المصاب باعتلال عضلة القلب السكري من عدم مرونة أيضية، حيث يعتمد بشكل كبير على أكسدة الأحماض الدهنية<sup> 3</sup> . ويؤدي فقدان هذه المرونة الأيضية إلى ضعف مزمن في طاقة قلب المصاب باعتلال عضلة القلب السكري<sup> 4 </sup>. وبينما تُعد الاضطرابات الأيضية عامل خطر معروفًا لتفاقم حالة اعتلال عضلة القلب السكري، لا توجد حاليًا أي علاجات مصممة خصيصًا لاستهداف أيض القلب في هذا المرض.
يحفز إنزيما الجلوكوكيناز والهيكسوكيناز فسفرة الجلوكوز إلى جلوكوز-6-فوسفات في الخطوة الأولى من عملية تحلل الجلوكوز. بينما يوجد الهيكسوكيناز في معظم الأنسجة، يتواجد الجلوكوكيناز بشكل أساسي في خلايا بيتا البنكرياسية والكبد ومجموعة فرعية من الخلايا التائية. في هذه الأنسجة، يعمل الجلوكوكيناز كمستشعر للجلوكوز، وينظم إفراز الأنسولين المحفز بالجلوكوز وامتصاص الجلوكوز في الكبد. ولذلك، يُعد تنشيط الجلوكوكيناز هدفًا واعدًا لعلاج داء السكري من النوع الثاني.
يُعدّ AZD1656 (AZD) مُنشطًا نوعيًا لإنزيم جلوكوكيناز، يتميز بانتقائية تفوق 100 ضعف مقارنةً بإنزيم هيكسوكيناز، وكان من المتوقع أن يُحقق تحكمًا فعالًا في مستوى السكر في الدم لدى مرضى السكري من النوع الثاني من خلال تأثيره على البنكرياس والكبد<sup> 5 </sup>. مع ذلك، في خمس وعشرين تجربة سريرية شملت 900 مريضًا بالسكري من النوع الثاني< sup > 6،7 </sup> ، فشل AZD في تحقيق هدفه الأساسي المتمثل في السيطرة على ارتفاع السكر في الدم، حيث لم يُحسّن مستويات الجلوكوز إلا لمدة تصل إلى أربعة أشهر. ومؤخرًا، تم اختبار AZD على مرضى كوفيد-19 المصابين بالسكري من النوع الثاني<sup> 8 </sup> كجزء من تجربة ARCADIA. أشارت نتائج هذه التجربة إلى تأثير مفيد لـ AZD، حيث قلّل العلاج من الوفيات، بينما أشار التنميط الظاهري الشامل للمرضى إلى تأثير مُعدِّل للمناعة للدواء <sup>8 </sup> . على وجه التحديد، أظهر التنميط الظاهري المناعي للخلايا التائية لدى المرضى أن مرضى كوفيد-19 المصابين بالسكري من النوع الثاني والذين عولجوا بـ AZD أظهروا استجابة مناعية أقل التهابًا واستجابة مناعية تكيفية أفضل من أولئك الذين عولجوا بدواء وهمي<sup> 8 </sup> .
يُعد الالتهاب المزمن سمة مميزة لداء السكري من النوع الثاني، ويترافق مع ارتفاع مستويات الخلايا التائية الهرمة شديدة الالتهاب في الدورة الدموية 2 ، 9 ، 10. قد تُحفز العوامل الالتهابية، مثل الإجهاد الأيضي الجهازي في داء السكري من النوع الثاني (فرط الأنسولين، فرط شحميات الدم، فرط سكر الدم، الإجهاد التأكسدي)، المناعة الذاتية التي تتوسطها الخلايا التائية، مما يؤدي إلى التهاب مزمن في القلب 1. على الرغم من ذلك، فشلت العديد من العوامل المضادة للالتهاب في تحسين وظائف القلب في التجارب السريرية، لأنها تستهدف في الغالب المناعة الفطرية والالتهاب الحاد 1 ، 11. كما ثبت أن فرط شحميات الدم الجهازي، الذي يميز داء السكري من النوع الثاني، يُعزز تمايز الخلايا التائية الذاكرة الفعالة (Tem) المُحفزة للالتهاب، بينما يُقلل من عدد الخلايا التائية التنظيمية، الضرورية لاستتباب المناعة 12 . في حالات الإجهاد الأيضي المزمن، مثل داء السكري من النوع الثاني، تبين أن ارتفاع مستويات الأحماض الدهنية في الدم يحفز تمايز الخلايا التائية المساعدة CD4+ وهجرتها إلى الأنسجة غير اللمفاوية، مما يعزز الالتهاب عن طريق إطلاق السيتوكينات المحفزة للالتهاب من الخلايا التائية وتفعيل الإنفلاماسوم الجهازي 1 ، 12. ومع ذلك، لا يزال من غير المعروف ما إذا كان الالتهاب الجهازي الذي تتوسطه الخلايا التائية في داء السكري من النوع الثاني يؤدي إلى التهاب عضلة القلب، وما إذا كان يؤثر على الاضطراب الأيضي في اعتلال عضلة القلب الناتج عن داء السكري.
نظراً للتأثير المحتمل لدواء AZD على تعديل المناعة، شرعنا في اختبار قدرته على تنظيم المناعة خلال الاضطرابات الأيضية والوظيفية القلبية في داء السكري من النوع الثاني. وقد أظهرنا أن التدخل الدوائي بدواء AZD لمدة ستة أسابيع في نموذج الفأر db/db المصاب باعتلال عضلة القلب الناتج عن داء السكري من النوع الثاني (dbCM) قد خفف من خلل الانبساط، وعكس إعادة تشكيل التمثيل الغذائي، وقلل من حجم الاحتشاء مقارنةً بالفئران المصابة باعتلال عضلة القلب الناتج عن داء السكري من النوع الثاني غير المعالجة. لم تكن التأثيرات الأيضية القلبية المفيدة لعلاج AZD ناتجة عن تغيرات أيضية جهازية في الكبد أو العضلات أو الأنسجة الدهنية، ولكن AZD قلل من التهاب وتليف عضلة القلب.
يعمل دواء AZD أيضًا على تنظيم التعبير الجيني في عضلة القلب، بما في ذلك الجينات المسؤولة عن الالتهاب، بالإضافة إلى تنظيم مسارات حيوية أساسية للبقاء على قيد الحياة ومسارات أيضية (مثل HIF-1α، وNrf2، وسيرتوين، وPPARα، والاستماتة الخلوية). وبالتالي، قد يمثل علاج AZD خيارًا علاجيًا جديدًا لمرض اعتلال عضلة القلب التوسعي (dbCM) من خلال استهداف عملية الأيض المناعي لتقليل التهاب عضلة القلب وتحسين إعادة تشكيلها.
المواد والأساليب
الحيوانات
تم شراء فئران مصابة بداء السكري من النوع الثاني (فئران db/db، من مختبر جاكسون، متماثلة الزيجوت BKS.Cg-Dock7 m +/+ Lepr db /J، ذكور، من شركة تشارلز ريفر، إيطاليا) في عمر 8 أسابيع، مع فئران ضابطة من نفس الفئة العمرية (غير متماثلة الزيجوت Dock7 m +/+ Lepr db ، من شركة تشارلز ريفر، إيطاليا). حُفظت الحيوانات في ظروف خالية من مسببات الأمراض، مع دورة ضوئية مظلمة مدتها 12 ساعة، ودرجة حرارة مضبوطة (20-22 درجة مئوية)، وتغذيتها بالعلف والماء حسب الحاجة . تمت مراقبة مستوى الجلوكوز في الدم (عينة من الذيل، جهاز Accu-Check، من شركة روش) ووزن الجسم أسبوعيًا. يتوافق هذا البحث مع توجيهات وزارة الداخلية البريطانية بشأن تطبيق قانون الحيوانات (الإجراءات العلمية) لعام 1986.
بروتوكول العلاج الدوائي AZD1656
AZD1656 (AZD، أسترازينيكا، المملكة المتحدة) هو مُنشِّط انتقائي لإنزيم جلوكوكيناز. لم تُلاحظ أي آثار سريرية هامة أو مخاطر سمية محددة بخلاف نقص سكر الدم في التجارب السريرية<sup> 13</sup> . قُسِّمت فئران db/db وفئران التحكم النحيلة إلى 3 مجموعات عند عمر 13 أسبوعًا: المجموعة الأولى - فئران التحكم النحيلة، نظام غذائي ضابط من Envigo diets (نظام غذائي للقوارض يحتوي على 19% بروتين من Teklad Global، مُشعَّع، من Teklad Custom Diets، Envigo، 2019)، المجموعة الثانية - فئران db/db، نظام غذائي ضابط من Envigo diets، والمجموعة الثالثة - فئران db/db، نظام غذائي يحتوي على AZD1656 (30 ملغم/كغم من وزن الجسم/يوم، من Envigo Specialist Diets، الولايات المتحدة الأمريكية؛ تم تحديد جرعة الدواء بناءً على المراجع<sup> 14 ، 15</sup> )، الشكل 1أ . كانت الأنظمة الغذائية متطابقة تمامًا من حيث التوحيد الغذائي، ولم يتأثر تناول الطعام بإضافة الدواء إلى النظام الغذائي. تم إبقاء الحيوانات (إجمالي الدراسة: المجموعة الأولى - الضوابط ن = 56، المجموعة الثانية - db/db ن = 55، المجموعة الثالثة - AZD ن = 49) على بروتوكول التغذية من عمر 14 إلى 20 أسبوعًا عندما وصلت الدراسة إلى نقطة النهاية.
أ ) ملخص بياني لبروتوكول علاج AZD. تم تغذية الفئران بنظام غذائي قياسي موحد غذائيًا ومطابق لنظام Teklad Standard Base Diet (Envigo) مع إضافة AZD1656 إلى النظام الغذائي المستخدم لمجموعة علاج db/db. ب ) تقييم تخطيط صدى القلب في الجسم الحي لنسبة E/A للصمام التاجي، ودرجات الخلل الانبساطي، والتصنيف بناءً على معايير تم التحقق من صحتها سابقًا في 20 و 21 . تم تلخيص التصنيف أيضًا في قسم الطرق. يمثل الخط المنقط متوسط نسبة E/A في المجموعة الضابطة. ج ) صورة نموذجية لقلب تم ترويته بتقنية لانغندورف. د ) هـ ) بيانات وظائف القلب بعد ترويته بتقنية لانغندورف (المجموعة الضابطة n=9، db/db n=9، AZD n=6). و ) مقاطع عرضية نموذجية للقلب مصبوغة بـ TTC بعد 20 دقيقة من نقص التروية الكلي وإعادة التروية لمدة ساعتين، والتي استُخدمت لتحديد حجم الاحتشاء. ز ) قياس حجم الاحتشاء بعد إصابة نقص التروية/إعادة التروية (db/db، AZD n=5/مجموعة، المجموعة الضابطة n=3) ح ) تحسن تعافي ضغط البطين الأيسر الانقباضي بعد نقص التروية في القلوب المروية بتقنية لانغندورف (المجموعة الضابطة n=5، db/db n=5، AZD n=6) و) *P<0.05، ***P<0.01 باستخدام تحليل التباين ANOVA
تحليل تكوين الجسم
أُجري تحليل تكوين الجسم باستخدام تقنية قياس الاسترخاء بالرنين المغناطيسي غير الجراحية، وذلك باستخدام جهاز EchoMRI™ لتحليل تكوين الجسم E26-348-MT (هيوستن، تكساس، الولايات المتحدة الأمريكية). تم استخدام عامل التراكم لضمان دقة فائقة (3×)، مما أدى إلى زمن مسح يبلغ حوالي 2.5 دقيقة.
تقييم وظيفة الانقباض والانبساط للبطين الأيسر في الجسم الحي
التصوير بالرنين المغناطيسي السينمائي
لتقييم وظيفة الانقباض، تم تصوير الفئران باستخدام جهاز رنين مغناطيسي بقوة 7 تسلا (أجيلنت، الولايات المتحدة الأمريكية) بتقنية التصوير بالرنين المغناطيسي السينمائي (CINE)، كما وُصف سابقًا<sup> 16</sup> . تم الحصول على 8 إلى 10 شرائح قصيرة المحور (سُمك الشريحة 1.0 مم؛ حجم المصفوفة 256 × 256؛ مجال الرؤية 25.6 × 25.6 مم؛ زمن الصدى/زمن التكرار 0.3/4.6 مللي ثانية؛ زاوية الانعكاس 30 درجة؛ وعدد المتوسطات 4) باستخدام تسلسل صدى التدرج، وتسلسل التصوير السريع بزاوية منخفضة< sup> 17</sup> . تم حساب أحجام البطين الأيسر باستخدام وظيفة الرسم الحر في برنامج ImageJ (المعاهد الوطنية للصحة). لكل قلب، تم حساب كتلة البطين الأيسر، وكسر القذف، وحجم الضربة، والنتاج القلبي.
تخطيط صدى القلب
أُجريت فحوصات تخطيط صدى القلب بتقنية M-mode وتقنية دوبلر على فئران المجموعة الضابطة، وفئران db/db، وفئران AZD في نهاية بروتوكول إعطاء الدواء، كما وُصف سابقًا في المراجع 18 و 19 . تم تخدير الفئران باستخدام 3% من الإيزوفلوران، وحُفظ التخدير عند تركيز يتراوح بين 0.5 و0.7% طوال مدة الإجراء. قبل تقييم وظائف القلب، أُزيل الفراء من منطقة الصدر لضمان دقة التقييم، وتُركت الفئران لتستقر لمدة 10 دقائق على الأقل. حُفظت درجة حرارة الجسم عند 37 درجة مئوية. أثناء تخطيط صدى القلب، قُيس معدل ضربات القلب من تخطيط كهربية القلب، وحُفظ ثابتًا بين المجموعات التجريبية. سُجلت صور تخطيط صدى القلب باستخدام نظام تصوير Vevo-3100 مزود بمسبار خطي بتردد 40 ميجاهرتز (VisualSonics، تورنتو، كندا). تم الحصول على صور تدفق الدم إلى البطين الأيسر عبر الصمام التاجي أثناء الانبساط من صور الأربع حجرات من قمة القلب باستخدام دوبلر الموجة النبضية لحساب سرعات تدفق الدم القصوى في مرحلتي الامتلاء المبكر (E) والمتأخر (الأذيني، A) وزمن تباطؤ الموجة E. تمثل نسبة E/A نسبة سرعة الموجة E إلى سرعة الموجة A. وُضع حجم العينة عند طرف وريقة الصمام التاجي في حلقة الصمام التاجي، وكان شعاع الموجات فوق الصوتية موازيًا لاتجاه تدفق الدم لتسجيل أقصى سرعات تدفق الدم عبر الصمام التاجي. تم قياس مساحة الأذين الأيسر في صور الأربع حجرات من قمة القلب، وتم تحديد حدود الأذين الأيسر قبل فتح الصمام التاجي مباشرةً في نهاية الانقباض البطيني. استند تقييم نسبة E/A للصمام التاجي، ودرجات الخلل الانبساطي، والتصنيف باستخدام تخطيط صدى القلب الحيوي . تم تعريف وظيفة الانبساط الطبيعية بأنها نسبة E/A تتراوح بين 1.0 و1.5 ، بينما تم تعريف خلل وظيفة الانبساط بأنها نسبة E/A أقل من 1.0 (ضعف في الارتخاء) ونسبة E/A أكبر من 2.0 (تقييد من الدرجة الثالثة والرابعة). تم تقييم وظيفة القلب دون معرفة النمط الظاهري.
مطيافية الرنين المغناطيسي المستقطبة للغاية
لتقييم استقلاب القلب في الجسم الحي ، استُخدمت مطيافية الرنين المغناطيسي فائق الاستقطاب لمراقبة مصير البيروفات [1-13C ] فائق الاستقطاب، كما وُصف سابقًا<sup> 22</sup> . أُجريت التجارب بين الساعة 7 و11 صباحًا عندما كانت الفئران في حالة تغذية. تم استقطاب 40 ملغ من حمض البيروفيك [1-13C ] (سيغما-ألدريتش) المُضاف إليه 15 ملي مول/لتر من جذر التريتيل (OXO63؛ جي إي هيلث كير) و3 مل من دوتاريم (مخفف بنسبة 1:50؛ جيربيت) استقطابًا فائقًا في مستقطب أولي، مع تعريضه لإشعاع الميكروويف لمدة 30-60 دقيقة<sup> 23</sup> . أُذيبت العينة لاحقًا في محلول قلوي مضغوط ومسخن، يحتوي على 2.4 غ/ل من هيدروكسيد الصوديوم و100 ملغ/ل من ملح ثنائي بوتاسيوم EDTA (من شركة سيغما-ألدريتش)، للحصول على محلول من 80 ملي مول/ل من بيروفات الصوديوم [1-13C ] المستقطب فائقًا باستقطاب يبلغ حوالي 30%. حُقن ما مجموعه 200 ميكرولتر على مدى 10 ثوانٍ عبر الوريد الذنبي. سُجلت أطياف القلب بتقنية الرنين المغناطيسي النووي للكربون -13 (13C) على مدى 60 ثانية بعد حقن بيروفات [ 1-13C ] المستقطب فائقًا (زمن التكرار: 1 ثانية؛ زاوية قلب الإثارة: 15 درجة؛ عرض المسح: 13021 هرتز؛ عدد النقاط المكتسبة: 2048؛ والتردد متمركز على رنين C1 للبيروفات)<sup> 22</sup> . تم جمع إشارة الكربون -13 من البيروفات ونواتج استقلابه على مدى 60 ثانية من ظهور البيروفات لأول مرة، وتمت مطابقتها باستخدام خوارزمية AMARES في برنامج jMRUI 24. تم الإبلاغ عن البيانات كنسبة بين ناتج الاستقلاب وإشارة البيروفات [1-13C ] لمعايرة الاختلافات في الاستقطاب ووقت التوصيل.
إرواء القلب بتقنية لانغندورف
تم تخدير الفئران تخديرًا نهائيًا، وتم استئصال قلوبها بسرعة، وتركيب قنية فيها، وإخضاعها للتروية كتحضير لانغندورف قياسي كما هو موضح سابقًا 25. تم تزويد محلول كريبس-هينسليت (KH) للتروية باستمرار بغاز 95% O2/5% CO2 (الأس الهيدروجيني 7.4، 37 درجة مئوية) يحتوي على (بالمليمول): NaCl (116)، KCl (4.7)، MgSO4.7H2O، KH2PO4 (x)، (1.2)، NaHCO3 (25)، CaCl2 (1.4)، ومُخصب بالمستقلبات [الجلوكوز (11)، إنتراليبيد 0.4 مليمول، 1 لاكتات الصوديوم L؛ 0.1 بيروفات الصوديوم؛ 0.5 ملح أحادي الصوديوم أحادي الهيدرات لحمض L-الجلوتاميك؛ تم حقن 5 ملي وحدة دولية/لتر من الأنسولين (نوفورابيد أنسولين، نوفو نورديسك، الدنمارك) وحُفز نبض القلب بمعدل 550 نبضة في الدقيقة عبر أقطاب كهربائية من أسلاك فضية موضوعة على قمة البطين الأيسر والأذين الأيمن. وقُيِّم تأثير 1 ميكرومول من AZD 26 على وظائف القلب وعمليات الأيض في قلوب غير محفزة تم ترويتها بمحلول منظم من البوتاسيوم عالي السكر (11 مليمول) مُحضر في أوانٍ زجاجية كهرمانية اللون مباشرةً قبل التجربة. وفي نهاية كل تجربة، تم تجميد القلوب والكبد والأنسجة الدهنية والعضلات (العضلة التوأمية والعضلة النعلية) فورًا باستخدام ملقط وولنبرغر لإجراء التحليل الأيضي.
تم قياس حجم احتشاء عضلة القلب كما هو موضح سابقًا<sup> 27</sup> . باختصار، بعد 20 دقيقة من التوازن، خضعت القلوب المروية بمحلول لانغندورف البلوري KH لنقص تروية شامل لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الجسم الطبيعية (37 درجة مئوية) وساعتين من إعادة التروية (37 درجة مئوية). في نهاية البروتوكول، تم تروية القلوب لمدة 10 دقائق بمحلول كلوريد ثلاثي فينيل تترازوليوم (TTC) بتركيز 3% في محلول KH، ثم حُضنت لمدة 10 دقائق في محلول TTC-KH بتركيز 3%. تم تقطيع الأنسجة (باستخدام مقياس قلب الفأر، من شركة زيفيك للأجهزة، الولايات المتحدة الأمريكية) وتم قياس منطقة الاحتشاء باستخدام برنامج ImageJ (المعهد الوطني للصحة).
تحليل الميتابولوميات
تم تحليل أنسجة مجمدة ومطحونة [القلب، الكبد، العضلات الهيكلية (العضلة التوأمية + العضلة النعلية)، الأنسجة الدهنية] باستخدام مطيافية الرنين النووي المغناطيسي للبروتون عالي الدقة، كما وُصف سابقًا في المراجع 28 و 29 . أُجري تحليل غير مُستهدف للدهون في أنسجة القلب باستخدام تقنية كروماتوغرافيا السائل - مطياف الكتلة (LC-MS/MS) في مختبر خدمات مطياف الكتلة التابع لكلية العلوم الكيميائية والفيزيائية. تم تصنيف أنواع الدهون إلى فئات وأنواع باستخدام برنامج Lipidmaps 30. ثم استُخدمت شدة إشارات مطياف الكتلة لترجيح مساهمات الأحماض الدهنية الجزيئية وحساب نسب الأحماض الدهنية لكل فئة والنسب الإجمالية.
تحليل استقلاب القلب باستخدام الحاسوب
أُجريت محاكاة حاسوبية باستخدام شبكة التمثيل الغذائي للخلايا العضلية القلبية، CardioNet 25. وقد استُخدمت النمذجة الرياضية سابقًا لدراسة ديناميكيات استقلاب القلب استجابةً للإجهاد، وطُبقت CardioNet بنجاح لتحديد العمليات الأيضية المُحدِّدة وتقدير توزيعات التدفق 25 ، 31 ، 32. وتم تعريف مسائل التحسين بهدف تقليل المجموع الكلي للتدفقات عبر شبكة التمثيل الغذائي CardioNet 33. واستندت المحاكاة لمجموعات التحكم، وdb/db، وAZD إلى افتراض أن الخلايا العضلية القلبية تسعى إلى الحفاظ على مستوى معين من ATP لدعم وظيفة انقباض القلب إلى جانب تخليق الجزيئات الكبيرة، بما في ذلك البروتينات الهيكلية والدهون الفوسفورية للأغشية 33 . أدرجنا تركيزات المستقلبات داخل الخلايا لـ 23 مستقلباً: NADH، والفورمات، ومخزون ATP/ADP، والفومارات، والجلوكوز، والكرياتينين (الفوسفوري)، والجليسين، والتورين، والكارنيتين، والكولين (الفوسفوري)، وأسيتيل كارنيتين، والأسبارتات، والجلوتامين، والجلوتامات، والساكسينات، والأسيتات، والألانين، واللاكتات، والفالين، والليوسين (الإيزوليوسين). علاوة على ذلك، قمنا بتقييد المستقلبات خارج الخلايا التي يمكن امتصاصها من الدم، بما في ذلك الجلوكوز، واللاكتات، والكوليسترول، والأحماض الدهنية الحرة. تم حل البرمجة الخطية باستخدام برنامج GUROBI (الإصدار 9.1.2، البناء v9.1.2rc0، Linux64) 34. تم تصنيف تفاصيل جميع التفاعلات وأنظمتها الأيضية الفرعية المستخدمة في تحليل CardioNet وفقًا لتصنيف قاعدة بيانات موسوعة كيوتو للجينات والجينومات. 35
استخلاص الأنسجة وهضمها لفرز الخلايا المنشطة بالفلورة
لتحضير معلقات خلايا الدم البيضاء المفردة لتوصيف تجمعات الخلايا المناعية، تم عزل قلوب الفئران وهضمها. ثم تم تخدير الفئران بجرعة زائدة من التخدير باستخدام 5% من الإيزوفلوران في 2 لتر/دقيقة من الأكسجين . تم التحقق من توقف ردود الفعل القدمية والقرنية، وتم تأكيد الوفاة عن طريق خلع الفقرات العنقية. تم تحضير معلقات أنسجة القلب عن طريق تروية القلوب بمحلول HBSS بارد لمدة 5 دقائق قبل إزالة الأذينين وتقطيع أنسجة البطين التي تم هضمها في الكولاجيناز الأول (مختبرات وورثينجتون، C1639، 450 وحدة/مل)، والكولاجيناز الحادي عشر (مختبرات وورثينجتون، C7657، 125 وحدة/مل)، وDNase 1 (مختبرات وورثينجتون، D4527، 60 وحدة/مل)، والهيالورونيداز (سيجما ألدريتش، H3506، 60 وحدة/مل)، و20 ملي مولار من هيبس في محلول ملحي فوسفاتي لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع التحريك اللطيف (ثيرموميكسر، 750 دورة في الدقيقة). تم تمرير العينات عبر مصفاة خلايا بمسام 70 ميكرومتر، ثم غُسلت بـ 10 مل من محلول فوسفات بارد يحتوي على 2% من مصل بقري جنيني، وخُضعت للطرد المركزي عند 400 غرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. أُزيل السائل الطافي، وأُعيد تعليق الرواسب في 5 مل من محلول تحلل خلايا الدم الحمراء (BioLegend)، وحُضنت على الجليد لمدة 10 دقائق مع التحريك من حين لآخر، ثم أُضيف 10 مل من محلول فوسفات بارد يحتوي على 2% من مصل بقري جنيني لمعادلة التحلل. بعد ذلك، خُضعت العينات للطرد المركزي لمدة 8 دقائق عند 4 درجات مئوية و400 غرام، ثم أُزيل السائل الطافي، وأُعيد تعليق الخلايا وحُضنت مع مُثبط FC (BioLegend 101320، 1 ميكرولتر لكل 1 × 10⁶ خلية/مل). ثم غُسلت الخلايا مرة أخرى وأُعيد تعليقها في محلول فوسفات لتكون جاهزة للعد والتلوين بالأجسام المضادة.
قياس التدفق الخلوي
عُلِّقت الخلايا المعزولة من القلوب (حوالي 10⁷ خلية /مل) وحُضِّنت لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع أجسام مضادة مُقترنة بصبغة فلورية (الجدول التكميلي 1) في 100 ميكرولتر من محلول قياس التدفق الخلوي المُحضَّر من محلول ملحي فوسفاتي يحتوي على 0.1% أزيد الصوديوم (سيجما-ألدريتش) و1% مصل بقري جنيني. ولتلوين المؤشرات داخل الخلايا، ثُبِّتت الخلايا ونُفِّذت عملية نفاذيتها لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية باستخدام مجموعة التثبيت/النفاذية (إي بيوساينس)، ثم غُسلت في محلول نفاذية بتركيز 1X (إي بيوساينس)، ولُوِّنت بأجسام مضادة مُقترنة بصبغة فلورية في محلول نفاذية بتركيز 1X لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية. أُجريت عملية غسل نهائية بمحلول نفاذية بتركيز 1X، ثم خُضعت الخلايا للطرد المركزي وأُعيد تعليقها في 200 ميكرولتر من محلول قياس التدفق الخلوي. بدلاً من ذلك، تم تثبيت الخلايا (باستخدام مجموعة Fix/Perfm، BioLegend 426803) وحفظها عند درجة حرارة 4 مئوية. تم تقييم حيوية الخلايا باستخدام حضانة مع أصباغ حيوية (الجدول التكميلي 1). تم تحليل العينات باستخدام جهاز FACSAriaIII (BD Biosciences) وبرنامج FACSDiVa الإصدار 8.0 (BD Biosciences، كلية دان لعلم الأمراض، جامعة أكسفورد). استُخدمت خرزات CD3 (Miltenyi، المملكة المتحدة) بشكل روتيني لمعايرة جهاز قياس التدفق الخلوي. تم الحصول على عينة واحدة مصبوغة وعينة تحكم ناقصة الفلورة للتعويض والتحديد الدقيق للبوابات (الشكل التكميلي 1: استراتيجية تحديد البوابات). تم حساب التعويض تلقائيًا، وتم تحليل العينات باستخدام برنامج FlowJo (الإصدار 10، FlowJo LLC، أوريغون، الولايات المتحدة الأمريكية).
علم الأنسجة
جُمعت القلوب في محلول فورمالين مُخفف (سيجما ألدريتش). أُجريت جميع عمليات المعالجة النسيجية في وحدة علم الأنسجة بمعهد بارتس للسرطان. ولتقييم التليف القلبي، صُبغت المقاطع المُضمنة في البارافين باستخدام صبغة ماسون ثلاثية الألوان. ثم فُحصت المقاطع القلبية المصبوغة باستخدام ماسح ضوئي بانورامي نانوزوم (تكبير 40x). وحُللت الصور (مقاطع القلب الكاملة) باستخدام برنامج ImageJ (المعهد الوطني للصحة).
تحليل البلازما
جُمعت عينات الدم عند نقطة نهاية التجربة في أنابيب مُعالجة بالهيبارين. أُجري تحليل البيوكيميائي للبلازما في مختبر الكيمياء الحيوية للفئران التابع لمجلس البحوث الطبية (مستشفى أدنبروكس التابع لهيئة الخدمات الصحية الوطنية، كامبريدج). قُيّمت السيتوكينات في بلازما الدم باستخدام مجموعة أدوات قياس السيتوكينات للفئران XXL (شركة بيوتكن، الولايات المتحدة الأمريكية) كما هو موضح سابقًا<sup> 36</sup> .
تسلسل الحمض النووي الريبوزي (RNA) والتحليل المعلوماتي الحيوي
تم تحليل الحمض النووي الريبوزي (RNA) المستخلص من القلوب المجمدة تجميدًا سريعًا باستخدام تقنية التحليل المكثف لنهايات الحمض النووي المكمل (MACE-Seq). استُخدمت تقنية Rapid MACE-Seq لإعداد مكتبات تسلسل الحمض النووي الريبوزي (RNA) من الطرف 3'. استُخدمت عينات من الحمض النووي الريبوزي (RNA) منزوع الحمض النووي (DNA) بتركيز 100 نانوغرام لإعداد المكتبات، باستخدام مجموعة Rapid MACE-Seq (شركة GenXPro GmbH، ألمانيا). خضع الحمض النووي الريبوزي (RNA) المجزأ لعملية النسخ العكسي باستخدام بادئات أوليجو (dT) المرمزة التي تحتوي على مُعرّفات جزيئية فريدة من TrueQuant، تلاها تبديل القالب. نُقّيت المكتبات المُضخّمة بتقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) باستخدام خرزات التثبيت العكسي ذات الطور الصلب، وأُجري التسلسل اللاحق باستخدام منصة Illumina NextSeq 500. خضعت قراءات التسلسل غير المُعالجة لعملية تقليم المحولات وتحسين الجودة باستخدام برنامج Cutadapt (الإصدار 3.4، 37 ). أُجريت عملية إزالة التكرارات بناءً على المُعرّفات الجزيئية الفريدة (UMIs) باستخدام أدوات داخلية. استُخدم برنامج FastQC (الإصدار 0.11.9، 38 ) لتقييم جودة قراءات التسلسل. واستُخدم برنامج MultiQC (الإصدار 1.16، 39 ) لإنشاء تقرير واحد يعرض مخرجات أدوات متعددة عبر عينات عديدة، مما يُتيح تحديد الاتجاهات والتحيزات العامة بسرعة. وتمت إضافة التعليقات التوضيحية إلى بيانات MACE-Seq، وتحديد كمية القراءات، وحساب قيم p للتعبير التفاضلي باستخدام برنامج GenXPro (فرانكفورت، ألمانيا).
تم إنشاء تمثيلات مرئية لمجموعة بيانات الجينات المتغيرة التعبير (DEG) باستخدام لغة البرمجة بايثون (الإصدار 3.9.7) بالإضافة إلى المكتبات والحزم التالية: Matplotlib (الإصدار 3.4.3) لعرض البيانات، وPandas (الإصدار 1.3.4) لإدارة البيانات، وNumPy (الإصدار 1.20.3) للحسابات العددية، وJupyter Notebook (الإصدار 6.4.5) لتطوير التعليمات البرمجية التفاعلية. أُجري تحليل الإثراء الوظيفي باستخدام g:Profiler (الإصدار e108_eg55_p17_0254fbf) مع تطبيق طريقة تصحيح الاختبارات المتعددة g:SCS، مع تطبيق عتبة دلالة إحصائية قدرها 0.05 . لتحديد المسارات والأنطولوجيات المُثرية في جميع مقارنات التحليل، أُجري كلٌ من تحليل مسارات Ingenuity (IPA؛ Ingenuity® Inc، ريدوود سيتي، كاليفورنيا) وتحليل مقارنة Metascape ( https://metascape.org ) 41 على جميع الجينات التي كانت قيمة p لها أقل من 0.05. وشملت المقارنات db/db_vs control (2740 جينًا مُعبَّرًا تفاضليًا) وAZ_vs_db/db (1271 جينًا مُعبَّرًا تفاضليًا). يستخدم كلٌ من Metascape وIPA اختبارات التوزيع الهندسي الفائق وتصحيح قيمة p وفقًا لـ Benjamini-Hochberg لتحديد جميع مصطلحات الأنطولوجيا والمسارات التي تحتوي على عدد أكبر من الجينات المشتركة مع قائمة الإدخال مقارنةً بما هو متوقع عشوائيًا 41 .
تحليل البيانات والإحصاءات
تُعرض البيانات كمتوسط ± الخطأ المعياري للمتوسط. أُجريت المقارنة بين المجموعات باستخدام اختبار t للطالب (لتوزيع البيانات الطبيعي)، وتحليل التباين ثنائي الاتجاه (ANOVA) مع تصحيح بونفيروني للمقارنات المتعددة، وتحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA) مع تصحيح بونفيروني للمقارنات المتعددة عند الاقتضاء. تم فحص طبيعية توزيع البيانات باستخدام اختبار شابيرو-ويلك. أُجري التحليل الإحصائي باستخدام برنامج GraphPad Prism (الإصدار 9). أُجري تحليل البيانات وتصويرها باستخدام برنامج R Studio (الإصدار 2022.12.0، البناء 353). أُجري تحليل التمييز الجزئي للمربعات الصغرى (PLS-DA) باستخدام حزمة mdatools في برنامج R. أُجري تحليل المكونات الرئيسية (PCA) باستخدام بيانات الشدة المُعَيَّرة لعلم الدهون باستخدام دالة PCA المُضمنة في حزمة factoextra .
تمت مقارنة تقديرات التدفق (CardioNet) بين المجموعات التجريبية باستخدام اختبار ويلكوكسون لترتيب الرتب، وحُسبت قيم p المعدلة باستخدام تصحيح بونفيروني. واعتُبرت الفروق ذات دلالة إحصائية عندما كانت قيمة p أقل من 0.05.
نتائج
يُحسّن علاج AZD وظيفة الانبساط في قلب مرضى السكري ويوفر الحماية من إصابة نقص التروية وإعادة التروية
تم تقييم تأثير علاج AZD لمدة 6 أسابيع ( الشكل 1أ ) على وظائف القلب في فئران dbCM في الجسم الحي باستخدام التصوير بالرنين المغناطيسي السينمائي وتخطيط صدى القلب ( الجدول 1 ). وكما ذُكر سابقًا<sup >42</sup> ، لم يُلاحظ أي انخفاض في وظيفة الانقباض لدى فئران db/db غير المعالجة، مع ملاحظة تغير طفيف ولكنه ذو دلالة إحصائية في كسر القذف، إلى جانب ثبات نتاج القلب ( الجدول 1 ). لم تكن هناك أي دلائل على احتقان رئوي أو أي زيادة في الوزن الكلي للقلب لدى فئران db/db ( الجدول 1 ). ومع ذلك، أظهرت فئران db/db درجات متفاوتة من خلل الانبساط ( الشكل 1ب ) وهو أمر شائع في فئران dbCM. ازداد زمن التباطؤ لدى فئران db/db، مما يشير إلى تطور خلل الانبساط وتصلب البطين الأيسر ( الجدول 1 ). أظهر تقييم التصوير بالرنين المغناطيسي السينمائي ( الجدول 1 ) ثبات حجم نهاية الانبساط وانخفاض حجم نهاية الانقباض. أكد التقييم الوظيفي خارج الجسم الحي بواسطة إرواء لانغندورف ( الشكل 1د ) بشكل إضافي وجود خلل في الانبساط في فئران db/db.
الخصائص المورفولوجية: وزن القلب الرطب (المجموعة الضابطة ن=15، مجموعة db/db ن=15، مجموعة AZD ن=11)، نسبة وزن القلب الرطب إلى طول عظم الظنبوب (المجموعة الضابطة ن=12، مجموعة db/db ن=10، مجموعة AZD ن=10). بيانات التصوير بالرنين المغناطيسي السينمائي (المجموعة الضابطة ن=18، مجموعة db/db ن=15، مجموعة AZD ن=11). تخطيط صدى القلب: زمن التباطؤ (ن=5/مجموعة)، مؤشر أداء عضلة القلب (المجموعة الضابطة ن=10، مجموعة db/db ن=9، مجموعة AZD ن=10)، نسبة تقصير عضلة القلب (المجموعة الضابطة ن=10، مجموعة db/db ن=9، مجموعة AZD ن=10). سرعة الذروة في الشريان الرئوي (المجموعة الضابطة n=5، مجموعة db/db n=3، مجموعة AZD n=5)، سرعة الذروة في الشريان الأورطي الصاعد (المجموعة الضابطة n=4، مجموعة db/db n=3، مجموعة AZD n=4)، اختبار كولموغوروف-سميرنوف لتوزيع البيانات الطبيعي، مقارنة المجموعات المتعددة باستخدام تحليل التباين أحادي الاتجاه مع اختبار بونفيروني للمقارنات المتعددة. P<0.05، تشير قيم P الفردية إلى مستوى الدلالة المذكور في عمود الجدول (قيمة P). ** P<0.005 مقارنة مجموعة db/db بالمجموعة الضابطة، ***P<0.0005 مقارنة مجموعة db/db بالمجموعة الضابطة، ++ P<0.05 مقارنة مجموعة AZD بمجموعة db/db
أدى العلاج بـ AZD إلى تحسين وظائف القلب في الجسم الحي ، حيث لوحظ تحسن في وظيفة الانبساط ( الشكل 1ب )، ومؤشر أداء عضلة القلب ( الجدول 1 )، وسرعة تدفق الدم في الشريان الرئوي المقاسة بتقنية دوبلر، وسرعة الذروة في الشريان الرئوي ( الجدول 1 )، وسرعة الذروة في الشريان الأورطي الصاعد ( الجدول 1 ). وقد ترافق هذا التخفيف من خلل وظائف عضلة القلب في فئران db/db مع حماية من إصابة نقص التروية وإعادة التروية، كما يتضح من انخفاض حجم الاحتشاء ( الشكل 1و، ز ) وتحسن ملحوظ في التعافي الوظيفي بعد احتشاء عضلة القلب مقارنةً بفئران db/db غير المعالجة ( الشكل 1ح ).
يُحسّن علاج AZD عملية التمثيل الغذائي للقلب في اعتلال عضلة القلب الناتج عن داء السكري
تميزت فئران db/db غير المعالجة بخلل استقلابي قلبي حاد ( الشكل 2 ). أكد تحليل المكونات الرئيسية للملف الأيضي، الذي تم تقييمه بواسطة مطيافية الرنين النووي المغناطيسي للبروتون عالي الدقة ( الشكل 2أ )، أن داء السكري من النوع الثاني يؤدي إلى ملف أيضي مميز في قلوب فئران db/db مقارنةً بالفئران الضابطة. على وجه التحديد، يتميز الملف الأيضي لفئران داء السكري من النوع الثاني بنقص ملحوظ في الأحماض الأمينية (الجلوتامين، والفالين، والجليسين، والتورين) والأسيتات، بالإضافة إلى تغيرات في وسائط دورة حمض الستريك (نقص الفومارات، وارتفاع السكسينات، الشكل 2ب ). بشكل عام، ارتبطت التغيرات الأيضية في قلوب فئران db/db بانخفاض في مخزون الطاقة (الفوسفوكرياتين، وATP+ADP، وPCr/ATP+ADP، الشكل 2ب ).
أ ) مخطط تحليل المكونات الرئيسية (PCA) لتحليل الميتابولوم باستخدام الرنين النووي المغناطيسي للبروتون (1H NMR). ب ) نسبة التغير في تحليل الميتابولوم باستخدام الرنين النووي المغناطيسي للبروتون (1H NMR) مقارنةً بالمجموعة الضابطة ، ن = 6/مجموعة. ج ) نسبة التغير في تحليل الميتابولوم باستخدام الرنين النووي المغناطيسي للبروتون (1H NMR) مقارنةً بالمجموعة الضابطة ، ن = 6/مجموعة . د ) تحليل توازن التدفق الأيضي باستخدام برنامج CardioNet بناءً على تحليل الميتابولوم باستخدام الرنين النووي المغناطيسي للبروتون ( 1H NMR) وتحليل الميتابولوم في البلازما (ن = 6/مجموعة). هـ ) عرض مرئي لتوقعات التدفق الأيضي لبرنامج CardioNet باستخدام برنامج Cytoscape. يتم تمثيل المستقلبات والتفاعلات كعقد وخطوط، على التوالي. يتناسب سمك الخط مع معدل التدفق المحسوب. و ) توقع معدلات استهلاك الأكسجين بناءً على محاكاة برنامج CardioNet. ز ) طيف تمثيلي مُعَلَّم من تقييم تدفق الأيض القلبي باستخدام مطيافية الرنين المغناطيسي النووي للكربون -13 (DNP MRS) في الجسم الحي . ح ) قياس تدفق دورة حمض الستريك (TCA) باستخدام مطيافية الرنين المغناطيسي النووي للكربون -13 (DNP MRS) في الجسم الحي (مجموعة التحكم n=12، مجموعة db/db n=16، مجموعة AZD n=10). مقارنة بين مجموعات متعددة باستخدام تحليل التباين (ANOVA). مقارنة ثنائية الطرف باستخدام اختبار t للطالب. *P<0.05 ***P<0.01 ****P<0.001
لتحليل خصائص التمثيل الغذائي القلبي في فئران db/db بشكلٍ أعمق، استخدمنا منهجية بيولوجيا الأنظمة التي تجمع بين علم الأيض والنمذجة الحاسوبية المقيدة .<sup >32 ، 43</sup> ولاستنتاج توزيعات التدفق، دمجنا بيانات علم الأيض المستهدفة من مجموعات التحكم، وفئران db/db، والمجموعات المعالجة بـ AZD في تحليل توازن التدفق (FBA). حُسبت توزيعات التدفق الأيضي باستخدام شبكة CardioNet<sup> 44 </sup> الخاصة بأيض القلب لدى الثدييات، استنادًا إلى التغيرات الكمية في تركيزات الأيض بين مجموعات التحكم والمجموعات التجريبية، بالإضافة إلى خصائص التمثيل الغذائي في الدورة الدموية. أكد تحليل توازن التدفق الحاسوبي لـ CardioNet لأيض القلب في فئران db/db وجود اختلاف ملحوظ في خصائص التمثيل الغذائي مقارنةً بمجموعات التحكم ( الشكل 2د ). كشفت المحاكاة الحاسوبية لفئران db/db عن زيادة في تحلل الجلوكوز اللاهوائي وتدفق الجلوكوز عبر مسار فوسفات البنتوز، بينما انخفضت أكسدة الجلوكوز في دورة كريبس ( الشكل 2هـ ). أدى التغير في إمدادات المغذيات خارج الخلية إلى تعزيز أكسدة الدهون ( الشكل 2هـ )، مما زاد من إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية ( الشكل 2هـ ) ورفع استهلاك الأكسجين بشكل ملحوظ ( الشكل 2و ). علاوة على ذلك، أظهر تقييم التدفق الأيضي في الجسم الحي باستخدام الرنين المغناطيسي فائق الاستقطاب للكربون -13 ( الشكل 2ز ) أن فئران db/db لديها تدفق نازعة هيدروجين البيروفات القلبي أقل بنسبة 95% في الجسم الحي ، مما يعكس انخفاضًا في أكسدة الجلوكوز القلبي ( الشكل 2ح ).
بشكل ملحوظ، أدى العلاج بدواء AZD إلى تحسين الخلل الأيضي القلبي في قلوب الفئران المصابة بداء السكري من النوع db/db. أظهر تحليل المكونات الرئيسية (PCA) أن النمط الأيضي بعد العلاج الدوائي كان متطابقًا بين قلوب الفئران المصابة بداء السكري من النوع db/db المعالجة بدواء AZD1656 وقلوب المجموعة الضابطة ( الشكل 2أ، الشكل التكميلي 2). كان النمط الأيضي باستخدام الرنين النووي المغناطيسي للبروتون ( 1H NMR) متقاربًا بين قلوب الفئران المصابة بداء السكري من النوع db/db المعالجة بالدواء وقلوب المجموعة الضابطة ( الشكل 2ج ) ، باستثناء الارتفاع المستمر فوق الطبيعي في مستوى السكسينات، وزيادة في مستوى NADH، وانخفاض في تركيز الجلوتامين. كما أظهرت النمذجة الحاسوبية تحسينات في تفاعلات التدفق الأيضي القلبي ( الشكل 2د )، بما في ذلك تحسن ملحوظ في أكسدة الدهون، وإنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS)، واستخدام مسار الهكسوزامين ( الشكل 2هـ ). تشير تحليلات تدفق CardioNet (البيانات التكميلية 1) إلى أن العلاج بـ AZD يؤدي إلى انخفاض ملحوظ في تحلل الجلوكوز اللاهوائي، مما ينتج عنه انخفاض في إطلاق اللاكتات مقارنةً بقلوب db/db. ومن أبرز التغيرات التي لوحظت بعد العلاج انخفاض استهلاك الأكسجين المحسوب بواسطة CardioNet بمقدار الضعف ( الشكل 2f )، ليعود إلى معدل قريب من المعدل الطبيعي. علاوة على ذلك، أظهر التصوير بالرنين المغناطيسي فائق الاستقطاب بالكربون -13 تحسنًا في تدفق الأيض القلبي في الجسم الحي ( الشكل 2h )، حيث لوحظ ازدياد في تحويل البيروفات [1-13C ] إلى البيكربونات [ 13C ]، مما يدل على زيادة تدفق PDH. والجدير بالذكر أنه في القلوب السليمة، لم يُحدث العلاج الحاد بـ AZD وحده أي تأثيرات أيضية أو وظيفية (الشكل التكميلي 3).
لزيادة دراسة تأثير AZD على استقلاب الدهون في القلب، قمنا بقياس توزيع ووفرة 13 فئة رئيسية من الدهون في أنسجة القلب بشكل شامل باستخدام تحليل MS/MS غير الموجه للدهون ( الشكل 3 ، البيانات التكميلية 2). وقد حللنا مجموعات بيانات الدهون باستخدام التصنيف متعدد المتغيرات الخاضع للإشراف، وذلك باستخدام تحليل التمييز الجزئي للمربعات الصغرى (PLS-DA).
أ ) تصوير وفرة الدهون باستخدام تحليل التمييز الجزئي للمربعات الصغرى (PLS-DA). تم تجميع العينات (عددها 5 لكل مجموعة) وفقًا للتكرارات البيولوجية، وقد غطى البعدان 1 و2 معًا 81.35% من التباين. ب ) مساهمة فئات الفوسفوليبيدات (PL) المتغيرة بشكل ملحوظ عبر العينات البيولوجية. MG: أحادي أسيل الجليسرول؛ PC: فوسفاتيديل كولين. ج ) تحليل المكونات الرئيسية (PCA) لملامح سلسلة أسيل PC. تمت مقارنة أطوال الكربون الكلية عبر العينات البيولوجية. غطى البعدان 1 و2 نسبة 84.4% من التباين. كان PC(40) وPC(26) هما المساهمان الأقوى في تغييرات PC في المعالجات. د ) اختلف متوسط طول السلسلة الكلي ودرجة التشبع بين المجموعات التجريبية.
في سياق الفصل المعتمد على المعالجة، تم رصد 81% من التباين الكلي في البُعدين الأولين ( الشكل 3أ ). أظهر الفوسفاتيديل كولين (PC) وأحادي أسيل الجليسرول (MG) تغيراتٍ ملحوظة في جميع المجموعات التجريبية الثلاث ( الشكل 3ب ). ضمن مجموعات الأحماض الدهنية (FA) في الفوسفاتيديل كولين، تم تحديد أطوال سلاسل الأحماض الدهنية الأكثر تأثيرًا من خلال تحليل المكونات الرئيسية (PCA، الشكل 3ج )، والذي أظهر أن الأحماض الدهنية FA26 وFA40 وFA38 هي السائدة. بالإضافة إلى ذلك، ساهمت الأحماض الدهنية FA34 وFA35 وFA36 في تباين الفوسفاتيديل كولين. وبناءً على ذلك، قمنا بتحليل دمج الأحماض الدهنية في الفوسفاتيديل كولين وتوزيع الروابط المزدوجة في جميع المجموعات التجريبية، ووجدنا أن فئران db/db لديها وفرة أقل من الأحماض الدهنية FA26 وFA40، بينما كانت وفرة الأحماض الدهنية FA38 أعلى مقارنةً بالحيوانات الضابطة. على النقيض من ذلك، أدى العلاج بـ AZD إلى عكس هذه الأنماط من الأحماض الدهنية نحو مستويات المجموعة الضابطة، وذلك بتقليل المساهمة الإجمالية للحمض الدهني 38 وزيادة وفرة الحمضين الدهنيين 26 و40. كان الحمض الدهني 26 مكونًا رئيسيًا للفوسفاتيديل كولين في جميع المجموعات التجريبية، حيث ساهم بأكثر من 40% من المجموع الكلي. انعكست هذه التغيرات أيضًا في توزيع الروابط المزدوجة ضمن فئة الفوسفاتيديل كولين. زاد كل من فئران db/db وAZD من تشبع أنواع الفوسفاتيديل كولين من أحادي عدم التشبع إلى 4 إلى 5 روابط مزدوجة. امتلكت فئران db/db غير المعالجة أطول سلاسل أسيل الفوسفاتيديل كولين وأكثرها عدم تشبع ( الشكل 3د ). في المقابل، تسبب العلاج بـ AZD في سلاسل أسيل أقل تشبعًا وأقصر. كانت نسبة ثنائي عدم التشبع إلى أحادي عدم التشبع أقل عادةً في قلوب فئران db/db غير المعالجة (0.07) مقارنةً بالحيوانات المعالجة بـ AZD (0.2) والمجموعات الضابطة (0.129).
لا تتوسط التغيرات في عملية التمثيل الغذائي الجهازي تأثيرات علاج AZD
لتقييم ما إذا كانت التحسينات الأيضية القلبية الناتجة عن علاج AZD ناجمة عن تغيرات أيضية جهازية في حيوانات db/db ( الشكل 4أ )، أُجريت تحليلات شاملة للدم والكبد والأنسجة الدهنية والعضلات الهيكلية. لم يُحسّن علاج AZD السمنة (وزن الجسم، الشكل 4أ، ب )، أو ارتفاع سكر الدم ( الشكل 4ج ، الشكل التكميلي 4)، أو فرط الأنسولين في الدم ( الشكل 4 د)، أو مقاومة الأنسولين (الأديبونكتين، الشكل التكميلي 4). في حين أن علاج AZD خفّض بشكل ملحوظ تركيز الأحماض الدهنية الحرة في الدورة الدموية ( الشكل 4هـ )، إلا أن مستوى المستقلبات المتبقية في الدورة الدموية لم يتحسن ( الشكل 4و، ز ، الشكل التكميلي 4). لم يُحسّن العلاج بـ AZD من النمط الظاهري للكبد لدى مرضى السكري ( الشكل 4ح ، ناقلة الألانين، الفوسفاتاز القلوي، الشكل التكميلي 4) أو عملية الأيض ( تحليل الأيض باستخدام الرنين النووي المغناطيسي للبروتون في الكبد ، الشكل 4ط، ي ، الشكل التكميلي 5أ). أدى العلاج بـ AZD إلى زيادة طفيفة في كتلة العضلات الخالية من الدهون مقارنةً بالوزن الطبيعي ( الشكل 4ك )، لكن تأثيره على أيض العضلات الهيكلية كان محدودًا ( الشكل 4ل، م ، الشكل التكميلي 6ب). علاوة على ذلك، لم يُقلل العلاج بـ AZD من كتلة الدهون في الجسم (الشكل التكميلي 6) ولم يُغير من تركيبة الدهون في الأنسجة الدهنية (الشكل التكميلي 6).
أ ) صور تمثيلية لفئران التحكم، وفئران db/db، وفئران db/db المعالجة بـ AZD من الدراسة. ب ) وزن الجسم (التحكم n=23، db/db n=17، AZD n=20) ج ) جلوكوز البلازما الصائم (n=9/مجموعة) د ) الأنسولين في البلازما (التحكم n=10، db/db n=11، AZD n=6) هـ ) مكونات استقلاب الدهون في الدورة الدموية [الأحماض الدهنية الحرة (التحكم n=11، db/db n=9، AZD n=5)، الكوليسترول (التحكم n=7، db/db n=10، AZD n=5)، ثلاثي الغليسيرول (التحكم n=7، db/db n=11، AZD n=9). توصيف النمط الظاهري للكبد (ح ) وزن الكبد (المجموعة الضابطة ن=12، db/db ن=11، AZD ن=7) (ط ) التغير النسبي db/db مقابل المجموعة الضابطة باستخدام مطيافية الرنين النووي المغناطيسي للبروتون ( ي ) التغير النسبي AZD مقابل المجموعة الضابطة باستخدام مطيافية الرنين النووي المغناطيسي للبروتون (المجموعة الضابطة ن=6، db/db ن=7، AZD ن=7) النمط الظاهري للعضلات الهيكلية (المجموعة الضابطة ن=6، db/db ن=6، AZD ن=5) (ك ) كتلة العضلات الخالية من الدهون عن طريق تحليل تكوين الجسم (ن=5/مجموعة) (ل ) التغير النسبي db/db مقابل المجموعة الضابطة باستخدام مطيافية الرنين النووي المغناطيسي للبروتون ( م ) التغير النسبي AZD مقابل المجموعة الضابطة باستخدام مطيافية الرنين النووي المغناطيسي للبروتون (ن=5/مجموعة) *P<0.05 **P<0.01، ***P<0.001 مقارنة بين مجموعات متعددة باستخدام تحليل التباين (ANOVA)، ومقارنة ثنائية الطرف باستخدام اختبار t للطالب. ملاحظة: تم قياس المعايير على مدار دراسة استمرت 6 سنوات في مجموعات متعددة، وبالتالي اختلف حجم العينة.
يقلل علاج AZD من الالتهاب والتليف القلبي الناتج عن الخلايا التائية في dbCM
وُصفت فئران db/db غير المعالجة بأنها تعاني من التهاب جهازي منخفض الدرجة، لوحظ من خلال تغيرات في مستوى السيتوكينات في الدورة الدموية ( الشكل 5أ ، الشكل التكميلي 7)، وكانت أكثر عوامل الالتهاب وفرةً هي MMP3، وSerpin F1، وPEDF، وEGF، وعامل المتممة D، وIFNγ، وPDGF.BB، وGDF 15، وFgF21، وserpin E1، وIL1، وmyeloperoxidase، وleptin، وosteoprogenerin، وIGFBP1، وLDL-R. بالإضافة إلى بيئة الالتهاب الجهازية، ترافقت الاضطرابات القلبية الأيضية والوظيفية في فئران db/db مع التهاب قلبي غير منظم بوساطة الخلايا التائية ( الشكل 5ب، ج ) وتليف ( الشكل 5د، هـ ). فيما يتعلق بتسلل أنواع الخلايا الالتهابية الأخرى، لم يكن هناك دليل على زيادة تسلل الخلايا البائية (B220)، أو الخلايا الوحيدة Ly6C-lo، أو الخلايا المتغصنة CD11c+، أو العدلات Ly6G+ أو البلاعم F4/80 ( الشكل 5f ) في قلوب db/db.
أ ) ملخص خريطة حرارية للوحة السيتوكينات XXL المنتشرة في البلازما (المجموعة الضابطة n=10، db/db n=12، AZD n=10 ب ) مخططات كونتورية تمثيلية لـ FACS ج ) التردد النسبي للخلايا التائية CD4+ في عضلة القلب، تم قياسه بواسطة FACS د ) مقاطع عرضية قلبية تمثيلية مصبوغة بصبغة ماسون ثلاثية الألوان هـ ) قياس شدة تلوين التليف بصبغة ماسون ثلاثية الألوان (المجموعة الضابطة n=5، db/db n=4، AZD n=4) و ) التردد النسبي للخلايا البائية، والخلايا المتغصنة، والعدلات، والبلعميات *P<0.05، **P<0.01، ***P<0.001. مقارنة بين مجموعات متعددة باستخدام تحليل التباين ANOVA.
أدى العلاج بدواء AZD إلى تحسين التهاب عضلة القلب لدى فئران db/db. حسّن الدواء من ضعف النفاذية المناعية للقلب، حيث لوحظ انخفاض في ارتشاح الخلايا التائية المساعدة CD4+ إلى عضلة القلب لدى فئران db/db المعالجة ( الشكل 5ج ) وتحسن في تليف عضلة القلب ( الشكل 5د، هـ ). لم يكن لدواء AZD أي تأثير على هجرة الخلايا المتغصنة أو العدلات أو البلاعم ( الشكل 4و )، إلا أنه تسبب في انخفاض ارتشاح الخلايا البائية إلى عضلة القلب ( الشكل 5و ). فيما يتعلق بملف السيتوكين القابل للذوبان، كان هناك تغيير ملحوظ مع علاج AZD ( الشكل 5أ ، الشكل التكميلي 7)، مع تغيرات كبيرة في التركيزات بما في ذلك سيربين E1/PAI-1، أنجيوبويتين-2، CXCL16، CCL20/MIP-3a، CXCL1، FGF21، BAFF/Blys/TNFSF13B، IL-12 p40، GDF-15، FGF الحمضي ( الشكل 5أ ، الشكل التكميلي 7).
يعمل العلاج باستخدام AZD على تطبيع التعبير الجيني للجينات التي تنظم المسارات الخلوية الرئيسية
تميز تطور اعتلال عضلة القلب الناتج عن داء السكري (dbCM) في فئران db/db بتغيرات ملحوظة في التعبير الجيني القلبي [1379 جينًا مختلفًا في التعبير (DEGs) بين db/db والمجموعة الضابطة، و503 جينات بين db/db وAZD، و1480 جينًا بين المجموعة الضابطة وAZD، الشكل 6أ ]. يُظهر تحليل إثراء الجينات باستخدام برنامج G profiler (الشكل التكميلي 8) أن dbCM تسبب في تغيرات واسعة النطاق في التعبير عن الجينات التي تتحكم في جوانب رئيسية من وظائف القلب: الوظائف الجزيئية، والعمليات البيولوجية، والمكونات الخلوية، والمجمعات البروتينية، بالإضافة إلى المسارات البيولوجية. يُظهر تحليل الجينات الثلاثين الأكثر ارتفاعًا في التعبير في قلوب db/db مقارنةً بقلوب المجموعة الضابطة أن 19 من بين الجينات الثلاثين الأعلى تعبيرًا هي وسائط التهابية ( الشكل 6ب ). كما حدد تحليل مخطط فين ( الشكل 6ج ) جينات متماثلة متداخلة مختلفة التعبير في قلوب db/db، والمجموعة الضابطة، وقلوب db/db المعالجة بـAZD. يُبرز تحليل مخطط فين لتشابه الجينات بين المجموعات زيادة التعبير عن الجينات الوسيطة للالتهاب ( Frp2، Ifitm6، Camp، Ltf، Ngp، Saa3 )، بما في ذلك وسيط هجرة الكريات البيضاء Selp، في فئران db/db مقارنةً بالفئران النحيلة ( الشكل 6ج ). كما حدد تحليل المسارات السمات الجينية المميزة لمرض dbCM، وأظهر زيادة التعبير عن المسارات الكلاسيكية، ومنظمات الوظائف الحيوية، والمنظمات الأولية ( الشكل 6د ) للالتهاب، والاستماتة الخلوية، وهجرة/تسلل الخلايا التائية، والإشارات الالتهابية، والتمثيل الغذائي (الدهون والكربوهيدرات) (الأشكال التكميلية 9-11).
تمثيل مرئي للجينات المتغيرة التعبير (DEGs) باستخدام ملخصات مخطط هيكسبين. تمثل قيم المحور السيني التغير اللوغاريتمي الثنائي (log2fold Change) مقابل المحور الصادي (log10 (P value)) لـ: أ ) db/db مقابل المجموعة الضابطة، وAZD مقابل db/db، وAZD مقابل المجموعة الضابطة. الحد الرأسي للمحور الصادي هو log2 (1.5) ± 0.585، والحد الأفقي للمحور السيني هو -np.log10(0.05) ∼ 1.301. ب ) أعلى 30 جينًا متغير التعبير (DEG) من حيث زيادة التعبير في db/db مقابل المجموعة الضابطة، وAZD مقابل db/db، وAZD مقابل المجموعة الضابطة. تشير الأشرطة الحمراء إلى منظمات الالتهاب، بينما يشير الشريط الأزرق إلى منظمات الالتهاب. ج ) مخطط فين للجينات المتماثلة المتداخلة المتغيرة التعبير (DEGs) بين مجموعات البيانات الثلاث (المجموعة الضابطة، وdb/db، وAZD). تم تحديد العتبة لتكون FC > 1.5 (أو < 1/1.5) و P < 0.05. تُعطى الجينات النموذجية (المتزايدة والمتناقصة) من كل مجموعة فرعية كما يلي: abs_diff_log2FC = abs(log2FoldChange_AZ_vs_dbdb - log2FoldChange_dbdb_vs_CTRL) د ) مخططات الخرائط الحرارية لقيمة -log p للجينات المتغيرة التعبير (DEGs) الناتجة عن اختبار التوزيع الهندسي الفائق وتصحيح قيمة p لـ Benjamini-Hochberg لتحديد جميع مصطلحات علم الوجود والمسارات التي تحتوي على عدد أكبر من الجينات المشتركة مع قائمة الإدخال مما هو متوقع عشوائيًا باستخدام برنامج Qiagen IPA 41. يتم التعبير عن ذلك كقيمة -log p في الخرائط الحرارية. جميع بيانات تسلسل الحمض النووي الريبوزي (RNA seq) المعروضة في هذا الشكل تستند إلى n = 6 قلوب/مجموعة.
أدى علاج داء السكري من النوع الثاني باستخدام AZD إلى تغيير ملحوظ في نمط التعبير الجيني المُعدَّل في قلوب مرضى السكري من النوع الثاني ( الشكل 6 أ، ب)، حيث عكس العلاج التعبير الجيني المرتفع بشكل مرضي في قلوب فئران db/db مقارنةً بالقلوب غير المعالجة (503 جينات، AZD مقابل db/db، الشكل 6 ب ). من بين أكثر 30 جينًا مُعبَّرًا بشكلٍ تفاضلي في قلوب فئران AZD مقارنةً بقلوب فئران db/db، وقلوب فئران AZD مقارنةً بقلوب المجموعة الضابطة، 8 جينات فقط (AZD مقابل db/db) و6 جينات (AZD مقابل المجموعة الضابطة) تُعدّ مُحفِّزة للالتهاب. والجدير بالذكر أن علاج AZD زاد أيضًا من تعبير Sfrp5 (بروتين التسلسل المرتبط بـ Frizzled 5)، وهو وسيط للحماية من الالتهاب والاستماتة الخلوية عبر تثبيط مسار Wnt5a/ JNK . أدى العلاج بدواء AZD إلى تقليل عدد الوسائط الالتهابية المشتركة والمتزايدة في مجموعة AZD مقارنةً بالمجموعة الضابطة إلى 3 جينات فقط (مخطط فين، GM4841، F830016B8Rik، Sfrp5 ، الشكل 6ج ). ويكشف تحليل المسارات أن العلاج الدوائي أدى إلى نمط معاكس لتعبير جينات مسار عضلة القلب: فعلى سبيل المثال، مسار رفض الطعم الخيفي الذي أظهر أكبر زيادة في التغير اللوغاريتمي في التعبير في db/db مقارنةً بالمجموعة الضابطة، هو الأقل تعبيرًا في db/db مقارنةً بمجموعة AZD (الشكل التكميلي 8). وشملت هذه التغيرات في التعبير الجيني الناتجة عن العلاج بدواء AZD أيضًا انخفاضًا في تعبير الجينات في مسارات إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية، واستقلاب الدهون، وآليات وإشارات التهابية متعددة ( الشكل 6د ).
بالإضافة إلى ذلك، استهدف العلاج بـ AZD وحسّن سلسلة كاملة من المسارات المشاركة في الوظائف البيولوجية ( الشكل 6د )، بما في ذلك النخر، وحركة الخلايا، ورفض الطعوم، والاستماتة الخلوية، وهجرة الكريات البيضاء، ومسارات الإشارات (سيرتوين، وNrf2، وإشارات الكبد، وهجرة الكريات البيضاء وإشاراتها، الشكل 6د ، الشكل التكميلي 8). علاوة على ذلك، أثر علاج AZD على مجموعة من المنظمات الأولية، بما في ذلك تحسين الإشارات المؤيدة للالتهاب (TGFβ1، وIFNγ، وIL4، وPPARα، الشكل التكميلي 8).
والأهم من ذلك، تم إظهار التأثير الآلي لعلاج AZD على قلوب db/db من خلال التحسن الكامل لإشارات خروج الكريات البيضاء المختلة التي تحكم ارتشاح الخلايا التائية إلى عضلة القلب (تغيير المكونات الوسيطة لمسار الإشارة من الأحمر إلى الأخضر، مسار Kegg المفصل في الشكل التكميلي 9) بالإضافة إلى مسارين رئيسيين لتنظيم التمثيل الغذائي: HIF1α (الشكل التكميلي 10) واستجابة الإجهاد التأكسدي بوساطة NRF2 (الشكل التكميلي 11).
مناقشة
بالنظر إلى التأثير المناعي المعدل المقترح سابقًا لـ AZD 8 ، 26 ، فقد بحثنا إمكانية أن يُحسّن هذا العلاج التهاب عضلة القلب، وبالتالي يُخفف من إعادة تشكيلها في فئران dbCM. وقد تم تحديد النمط الظاهري للالتهاب الجهازي بوساطة الخلايا التائية على نطاق واسع في داء السكري من النوع الثاني 46 وحالات الإجهاد الأيضي المزمن الأخرى 2 ، 47 ، إلا أن التهاب عضلة القلب في داء السكري من النوع الثاني لا يزال بحاجة إلى تحديد ودراسة خصائصه. وكما لوحظ سابقًا، تميزت فئران db/db البالغة من العمر 20 أسبوعًا بالخصائص الظاهرية التي تُمثل داء dbCM البشري: السمنة، وارتفاع سكر الدم، وضعف وظيفة الانبساط ( في الجسم الحي وخارجه ) (ملخص في الشكل 7 ). أظهر تحليل قلوب الفئران المصابة بداء السكري من النوع db/db لمدة 20 أسبوعًا وجود مناعة ذاتية واسعة النطاق بواسطة الخلايا التائية مصحوبة بزيادة في إنتاج السيتوكينات المؤيدة للالتهابات والتليف، والذي كان متزامنًا مع تغير استقلاب القلب: تم إثبات ذلك من خلال استخدام الركيزة في الجسم الحي ( مطيافية الرنين المغناطيسي النووي للكربون -13 المستقطبة )، والطاقة، والفسفرة التأكسدية، واستقلاب الأحماض الأمينية ( مطيافية الرنين المغناطيسي النووي للبروتون ).
قد يُمثل علاج AZD مفهومًا علاجيًا جديدًا لعلاج اعتلال عضلة القلب السكري، وذلك باستخدام جزيئات صغيرة تستهدف عملية التمثيل الغذائي المناعي للحد من التهاب عضلة القلب لدى مرضى السكري. (الشكل مُنشأ باستخدام Birender.com)
ومن اللافت للنظر أن العلاج الدوائي لمدة 6 أسابيع باستخدام AZD قد خفف من إعادة التشكيل الوظيفي والأيضي الذي لوحظ في قلب مرضى السكري غير المعالج، مما أدى إلى تحسين التعافي الوظيفي بعد نقص التروية وتقليل الضرر الناتج عن نقص التروية.
يُعدّ فقدان المرونة الأيضية أحد التحديات الرئيسية في اعتلال عضلة القلب الناتج عن داء السكري من النوع الثاني (dbCM)<sup> 48</sup> . ومع ذلك، حقق العلاج بدواء AZD تحسينات ملحوظة في خصائص الأيض القلبي وتدفقه، كما لوحظ من خلال التقييم الأيضي الحيوي والحاسوبي . تشير هذه التغييرات إلى تحسن مرونة استخدام الركائز الأيضية. علاوة على ذلك، أدى التدخل الدوائي بدواء AZD في فئران db/db إلى انخفاض استهلاك الأكسجين في القلب بنسبة 68%. وقد ثبت أن زيادة استهلاك الأكسجين في عضلة القلب وهدر الأكسجين نتيجةً لاختلال وظيفة الميتوكوندريا يقللان من كفاءة القلب في داء السكري من النوع الثاني<sup> 49 ، 50 </sup> . لذا، يُعدّ انخفاض استهلاك الأكسجين بعد العلاج بدواء AZD أمرًا بالغ الأهمية لتحسين وظائف القلب والحد من أضرار نقص التروية وإعادة التروية. كما تميز اعتلال عضلة القلب الناتج عن داء السكري من النوع الثاني في فئران db/db باختلافات في تركيب سلسلة الأحماض الدهنية للجليسروليبيدات، مثل فوسفاتيديل كولين، بالإضافة إلى أحادي أسيل الجليسرول. أدى العلاج بدواء AZD إلى تحسن ملحوظ في تركيب الفوسفوليبيدات القلبية، مما يشير إلى تحسن استقلاب الدهون، بالإضافة إلى سلامة غشاء الخلية والميتوكوندريا 51 52. أظهرت دراساتنا أن التدخلات الدوائية التي تخفف من التغيرات الناجمة عن السمنة في تركيب الفوسفوليبيدات وتوازنها تؤثر إيجابًا على استقلاب القلب ووظيفته. أظهر تحليل تسلسل الحمض النووي الريبوزي (RNA) لأنسجة القلب أن العلاج بدواء AZD حسّن بشكل ملحوظ من التعبير الجيني، بما في ذلك الجينات التي تتحكم في مسارات الاستجابة الأيضية والالتهابية الرئيسية (مثل HIF1α، وPGC1α، والاستماتة، والنخر، وهجرة الكريات البيضاء، واستقلاب الأحماض الدهنية، والفسفرة التأكسدية).
ربما تحققت نتائج العلاج التجريبي بدواء AZD من خلال آليتين محتملتين: إما عن طريق تحسين التحكم في مستوى السكر في الدم (وهو الاستخدام الأصلي للدواء) أو عن طريق تعديل الاستجابة المناعية . وبما أنه لم يتم رصد أي اختلافات في التحكم في مستوى السكر في الدم بين المجموعات، فمن غير المرجح أن تكون الاختلافات في النتائج ناتجة عن تأثير AZD في خفض مستوى الجلوكوز.
علاوة على ذلك، لم تتأثر ملامح الأيض الجهازية في الدم والكبد والأنسجة الدهنية والعضلات الهيكلية بشكل كبير، وبالتالي فإن أي آثار مفيدة لوحظت في قلوب الفئران المعالجة بـ db/db لم تكن ناتجة عن تحسينات ملحوظة في استقلاب الأنسجة الطرفية الجهازية (الكبد والعضلات). ومع ذلك، فقد لاحظنا انخفاضًا ملحوظًا في تركيز الأحماض الدهنية في الدورة الدموية مع زيادة مصاحبة في محتوى دهون الجسم بعد العلاج بـ AZD. وقد يكون هذا قد ساهم في تحسين استقلاب عضلة القلب والالتهاب.
كان من شأن انخفاض مستويات الأحماض الدهنية في الدورة الدموية أن يؤثر على استقلاب عضلة القلب، وتحديدًا تدفق إنزيم نازعة هيدروجين البيروفات (PDH) عبر تنظيم الأحماض الدهنية لإنزيم PDK4 53 ، 54، ويقلل من تكاثر الخلايا التائية الالتهابية الجهازية 55. يتم تثبيط أكسدة الأحماض الدهنية عند تنشيط الخلايا التائية، مما يؤثر على تنظيم بروتينات نقاط التفتيش المناعية 56. وقد رُبط التهاب الخلايا التائية سابقًا بتطور قصور القلب في كل من نماذج الأمراض الحيوانية والبشر 57. أدى الحصار التحفيزي المشترك للخلايا التائية، باستخدام دواء أباتاسيبت المستخدم في علاج التهاب المفاصل الروماتويدي، إلى تقليل شدة خلل وظائف القلب بشكل ملحوظ في حالات قصور القلب. حدث هذا التأثير العلاجي من خلال تثبيط تنشيط الخلايا التائية والبلعميات الكبيرة وتسللها إلى القلب، مما أدى إلى تقليل موت خلايا عضلة القلب 57. إحدى الخصائص الرئيسية لمرض اعتلال عضلة القلب الناتج عن داء السكري (dbCM) هي زيادة الخلايا الليفية التي ثبت أنها تعمل كخلايا عارضة للمستضدات 58، مما يؤدي إلى تسلل الخلايا التائية إلى عضلة القلب والالتهاب 59 .
تشير بيانات التنميط المناعي هنا إلى أن العلاج بدواء AZD يُحدث تأثيرًا مُعدِّلًا للمناعة في فئران db/db عبر تقليل نفاذية الخلايا التائية والبائية في عضلة القلب، فضلًا عن تقليل التليف. ويتوافق هذا مع إعادة توازن الاستجابة المناعية التي لوحظت في تجربة ARCADIA على مرضى السكري من النوع الثاني المصابين بكوفيد-19 .<sup >8 </sup> وفيما يتعلق بالبيئة الالتهابية المنتشرة، يشير التغير في بيانات الكيموكينات المحيطية إلى تغيرات في الكيموكينات الذائبة، بدلًا من الكيموكينات المرتبطة بالغشاء، والتي يتم شطرها بواسطة MMP9، والتي زادت أيضًا مع تناول AZD. وقد يُثبِّط التغير الناتج في نمط الكيموكينات بعد العلاج الدوائي الاستجابات الالتهابية، حيث يمنع ارتباطها بالكيموكينات المرتبطة بالغشاء. على سبيل المثال، يُشير التغير في مستوى IL-12 المنتشر إلى انخفاض وظيفة الخلايا التائية الفعالة وتنشيط الخلايا المتغصنة . <sup> 36</sup>
أسفرت نتائج تجربة ARCADIA عن مفهوم علاجي جديد في مجال المناعة الأيضية: استهداف الخلايا المناعية الذاتية دوائيًا لتحويلها إلى عوامل علاجية داخل الجسم 8. وقد فشل هذا النهج في تطوير الأدوية سابقًا، سواءً استُخدم مع خلايا مُعالجة خارجيًا أو مُهندسة 8 ، 60-62 . تُساهم نتائج دراستنا في مجال علم المناعة القلبية المتنامي، إذ تُشير إلى إمكانية استخدام AZD كدواء جديد مُعدِّل للمناعة لتخفيف الخلل الأيضي القلبي في داء السكري من النوع الثاني ، فضلًا عن مجموعة واسعة من الأمراض الالتهابية غير الجرثومية.
توافر البيانات
بيانات تسلسل الحمض النووي الريبوزي متاحة (مفتوحة الوصول) على Array Express برقم الوصول E-MTAB-13849. جميع البيانات الأولية مودعة على Dryad (مفتوحة الوصول).
تضارب المصالح
DA – دراسة بحثية واتفاقية خيار ترخيص حصري مع شركة أسترازينيكا في المملكة المتحدة لدراسة تأثير AZD1656 على حركة الخلايا التائية واستقلاب القلب. DS – موظف ومساهم في شركة أسترازينيكا.
شكر وتقدير
يعترف DA بالسيدة إيرينيا كوبيلا (معهد بارتس للسرطان، QMUL)، والدكتور هارولد تومز، والدكتور روبرتو بوكافوسكا، والدكتورة نسيمة كانوال (كلية العلوم الفيزيائية والكيميائية، QMUL)، والدكتور ت. إيكين (كلية كينغز لندن) للحصول على المساعدة الفنية.
حصل DA على زمالة ويلكوم ترست لإعادة الانخراط في العمل [221604/Z/20/Z]، ويُقرّ بالدعم المالي المُقدّم من مصادر التمويل التالية: زمالة جائزة تسريع مؤسسة القلب البريطانية [AA/18/5/34222]، ومنحة جمعية السكري في المملكة المتحدة (19/0005973)، ومنحة مؤسسة بارتس الخيرية (MRC 0215)، وشركة أسترازينيكا في المملكة المتحدة (اتفاقية الدراسة رقم 3853)، وكلية العلوم البيولوجية والسلوكية بجامعة كوين ماري بلندن (محاضرة HEFCE). مُوِّلَ SMH من قِبَل جمعية السكري في المملكة المتحدة 19/0006057، ومُوِّلَ CGK من قِبَل مؤسسة بارتس الخيرية ومؤسسة لندن الخيرية MGU0536. مُوِّلَ DJT من قِبَل زمالات أبحاث العلوم الأساسية العليا لمؤسسة القلب البريطانية (FS/14/17/30634 وFS/19/18/34252). تلقى SA تمويلًا من منحة بيلي-كاريس بانيستر الدراسية، كلية سومرفيل، جامعة أكسفورد. وتلقى AK دعمًا من المعاهد الوطنية للصحة (NIH) (R00-HL-141702 إلى AK)، ومؤسسة أبحاث سرطان الدم (جائزة الباحث الجديد، المنحة رقم 941997)، ومركز سيدارز-سيناي للسرطان من خلال جائزة برنامج بيولوجيا السرطان لأمراض القلب والأورام لعام 2022. ويُقر MRB بالتمويل المُقدم من مركز أبحاث الطب الحيوي التابع للمعهد الوطني للبحوث الصحية في كلية بارتس ولندن للطب وطب الأسنان. ويُقر LJA بمنحة برنامج مؤسسة القلب البريطانية RG/12/4/29426. وتلقى CO'R رعاية من كلية بارتس ولندن للطب وطب الأسنان، جامعة كوين ماري في لندن. وتلقى JC دعمًا من زمالة تطوير المسار الوظيفي من مؤسسة Versus Arthritis UK (22855). تم دعم هذا العمل من قبل مجلس البحوث الطبية في المملكة المتحدة (MC_UU_00028/4) ومنحة باحث من مؤسسة ويلكوم ترست (220257/Z/20/Z) إلى MPM. كما تم دعم هذا البحث من قبل مختبر الكيمياء الحيوية للفئران التابع لمجلس البحوث الطبية في كامبريدج [مجلس البحوث الطبية (MC_UU_00014/5)]. تم إنشاء الشكل 1أ والشكل 7 باستخدام موقع Biorender.com.
ليست هناك تعليقات:
إرسال تعليق